初次使用荧光笔时，应当将荧光笔进行数次摇动，能够使荧光笔中的墨水进行有效的活动和混合，然后对着比较坚硬的平面或者是桌子表面轻按笔尖，就像是弹簧一样来回进行挤压，等到墨水从笔尖处渗出来之后就可以进行书写。在写时，要匀速书写，不要过快，以免墨水不能流畅的渗出。
荧光笔有荧光剂，它遇到紫外线（太阳光、日光灯、水银灯比较多）时会产生荧光效应，发出白光，从而使颜色看起来有刺眼的荧光感觉。荧光笔的荧光跟我们手表、荧光棒的荧光原理不相同，荧光棒是内部发生放射性反应，产生的射线激发外周的荧光粉发光，因此它们在夜里没有任何紫外线的情况下都能发光。而荧光笔则一定有紫外线情况下才会发荧光，这一点你只要把荧光笔的笔迹靠近捕蚊灯、验钞机就可以看得非常清楚。
荧光笔的原理是通过吸收的光能，产生原子的能级跃迁，再释放吸收的额外能量。荧光笔中所加的是一些荧光剂。有些荧光物质有毒，具有潜在的致癌成分，长期使用对人体有害，而且价格便宜。一些小作坊为了减轻成本，会使用有毒的荧光剂作为荧光笔的原料。另外，由于荧光笔中含大量荧光剂，长期使用，也会严重影响孩子的视力。
荧光笔常用于绘画和作记号。挑选时可将两张半透明的报告纸或打字纸叠在一起，在上面一张纸上用荧光笔写几个字，注意轻重顿挫，然后翻过来检查，质量好的荧光笔在上面一张纸的背面应无颜色渗透，下面一张纸上应绝无笔迹。